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　　摘要:以水牛胎儿为材料,从生殖腺中分离培养出牛原始生殖细胞,并对水牛原始生殖细胞的分离与克

　　隆的影响因素进行了探讨.结果发现:(1)分离培养出的原生殖细胞(PGCs)呈集落状生长.细胞堆积密集,细

　　胞之间界限不清.细胞与周围的成纤维细胞界限明显;未分化的细胞表达碱性磷酸酶(AKP)以及OCt一4转录

　　因子;(2)收集妊娠29～100d牛胎)L28例,从生殖嵴(腺)或类似物中分离克隆水牛PGCs,23例出现PGCs

　　落.结果表明,水牛原生殖细胞具有多能性特性,胎龄小于55d的水牛胎儿易于分离培养形成PGCs集落.

　　分化发育成三个胚层细胞的潜力)的细胞.DeFelici等Ⅲ用EDTA/percoll法分离得到较多数量的小鼠

　　增刊李童等:水牛原始生殖细胞(PGCs)的分离培养及生物学特性的研究47

　　细胞仅存活3d.直到1992年Matsui等以分离附植后小鼠胎儿的原始生殖细胞为材料,培养传代获

　　得ES细胞.该细胞排列紧密,AKP(碱性磷酸酶)染色和SSEA一1(阶段特异性胚胎表面抗原一1)均

　　呈阳性,并能形成类胚体,囊胚注射表明其具有参与嵌合体组织形成的能力,从而首次较为全面地证

　　实了PGCs同样可作为ES细胞分离克隆的原材料.目前,从PGCs中分离克隆ES细胞,在小鼠m,大

　　鼠口],猪?],人n和牛【1上已经取得重要进展,但在水牛方面,国内尚无该方面的报道.

　　本研究欲通过对水牛PGCs分离和培养的研究,对水牛PGCs生物学特性进行初步鉴定,并探讨胎

　　龄和培养方法对分离和培养结果的影响,以初步确定水牛胚胎性多能干细胞的生物学特性,确定分离

　　和培养水牛PGCs的合适的胎龄和培养的基本方法,为进一步建立牛EG细胞系奠定一定的基础.

　　1.2.1水牛胎儿的处理将胎牛用75的酒精消毒5～10min,打开腹腔,取出性腺,PBS洗2遍,用

　　1.2.2PGCs的分离培养将上述弄碎的性腺加入少量PGC细胞培养基,然后用1mI注射器反复吹

　　打将细胞分离后转移到35mm平皿中;如胎龄较大(体长≥12cm),则反复吹打后在显微镜下用吸管

　　将分散的小组织块挑出来转移到35mm平皿中.最终加培养液1.5mI,置于37C,5CO的培养箱

　　1.2.3细胞碱性磷酸酶组化染色(AKP)在接种PGCs细胞的培养皿,用PBS洗涤3次,然后以4

　　多聚甲醛固定3Omin,再用PBS洗涤3次,每次5min,然后以添加硝基四氮唑蓝,室温下避光显色

　　1～3h;显微镜观察显色程度适当则用蒸馏水冲洗,终止反应,然后显微镜下观察.

　　1.2.4免疫荧光检测PGCs中Oct一4的表达所有一抗和二抗都用含1BSA的PBS按一定比例稀释.

　　非特异性染色.然后用PBS洗涤2次后分别加第一抗体,在37C温育1h.PBS洗涤2次后,用二抗

　　(兔抗小鼠IgGFITC标志物)在室温下避光温育30~45min.PBS洗涤2次后,用荧光显微镜观察.

　　在实体显微镜下无菌剥离出牛胎儿生殖嵴/腺或类似物,分离出PGCs,接种在饲养层上.在倒置

　　显微镜下观察,PGCs呈圆形或椭圆形,比周围的体细胞大,核大胞质少,所形成的类EG细胞集落具

　　有典型的ES细胞集落形态,隆起,边缘整齐,集落中细胞排列致密,看不出明显的细胞间隔.有的集

　　落边缘出现许多单个细胞,变得不整齐;有的集落中央出现发黑的若干团块,可能是PGCs细胞分化和

　　凋亡的表现(图1).AKP染色:牛PGCs细胞集落着黑色,呈阳性,饲养层细胞不着色,为阴性(图2).

　　Oct一4:牛PGCs细胞进行免疫荧光检测呈阳性,出现绿色荧光(图3).

　　收集的28例牛胎儿分成4个阶段,胎龄小于45d(体长小于3.0cm)的7例,全部出现PGCs集

　　出现PGCs细胞集落;大于70d的5例,有2例出现PGCs细胞集落.可见:胎龄在70d以内的牛胎儿

　　适合分离培养PGCs;胎龄过大(70d)较难分离或者说不适合做PGCs的分离,5例中只有2例出现

　　牛PGCs细胞集落形态与小鼠EG细胞相似,呈圆形或椭圆形,比周围的体细胞大,集落边缘整齐,

　　隆起,细胞问界限不清,折光性强(图1),与前人的描述基本一致,但形态学方面的鉴定只能起一个

　　AKP染色通常作为ES及EG细胞鉴定的一种常用的染色方法.牛EG细胞AKP染色不稳定,有

　　的学者认为牛EG细胞AKP染色呈阳性,有的学者则认为AKP染色呈阴性.至于不同的学者报道牛ES

　　细胞的AKP表达的差异,可能与不同的材料来源和牛ES细胞分化程度和表型有关,更可能与实验室

　　的具体情况和实验者的具体操作(染色程序)有关.在本实验条件下对原代的牛PGCs细胞进行染色,

　　发现AKP染色呈阳性(图2),但AKP活性能否作为牛多能干细胞的特异标记还有待于进一步研究.

　　Oct一4是维持细胞多能性的一个重要转录因子,是POU家族成员,缺乏Oct一4的胚胎在附植后不久死

　　亡,因为其ICM不能正常发育,它在早期胚胎发育过程中起着重要的作用.同时,ES和EG细胞分化

　　的表达模式和基因剔除实验表明,Oct一4对维持ES和EG细胞未分化状态是必不可少的.Oct一4基因在

　　种系细胞和未分化的干细胞中表达,当分化时表达中止,本实验对原代牛PGCs细胞进行免疫荧光检测

　　呈阳性,出现绿色荧光(图3),可初步确定本实验分离培养的PGCs细胞具有多能性.

　　在家畜和人EG细胞分离克隆时胎龄的选择方面,不同种动物有所不同.猪取24～28dpc胎儿生殖

　　儿生殖嵴;山羊取25dpc龄胎儿生殖嵴;人取5～9w胎儿生殖嵴u.徐小明等的研究中,16例

　　55~70dpc的胎儿中有5例得到PGCs集落,1例传至3代.本试验收集28例水牛胎儿PGCs分离培养

　　时,发现胎龄大小对牛EG细胞分离克隆影响很大,分离与培养水牛PGCs的胎龄不应超过90dpc(冠

　　臀长小于9.0cm).胎儿太大,生殖嵴已转变为性腺,PGCs也大部分分化成生殖细胞,因而很难分离

　　到PGCs.本实验结果表明,胎龄在90dpc以下的胎儿均能分离到水牛PGCs细胞,但胎龄在55dpc以

　　胎儿的集落形成率明显高于55dpc以上的水牛胎儿,可以推断出胎龄在29～55dpc(体长约为

　　1.0～5.0cm)的水牛胎儿比较适合水牛PGCs细胞的分离与培养,胎龄在55dpc以上的水牛胎JLPGCs

　　克隆形成率明显下降,但仍然可以用于水牛PGCs细胞的分离与培养,胎龄大于90dpc(体长大于9.0

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